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干货分享 | 一抗孵育的流程及注意事项,试管代孕功略_最佳代孕公司
来源: 武汉华夏科技
作者: admin
时间: 2025-03-15 10:18:37
一抗孵育基于抗原抗体特异性结合，一抗可以特异性地识别并结合靶蛋白，从而对靶蛋白进行定性与半定量分析。
一抗孵育流程
根据抗体说明书稀释一抗，高倍稀释一抗可减少非特异性信号。封闭液可作为抗体稀释液，也可使用1×TBST稀释一抗；
将膜浸泡在稀释好的一抗中，需保持适当的摇动使之均匀覆盖。常见的一抗孵育条件为室温1.5-2 小时或4 °C过夜，具体取决于抗体与蛋白的亲和性和蛋白的丰度，建议使用较高的抗体稀释倍数和较长的孵育时间来保证特异性结合。另外，低温可以减少细菌生长和蛋白降解 (尤其是磷酸基团
)；
一抗孵育结束后，通过洗膜去除未结合的抗体，否则会导致高背景。常用的清洗缓冲液是PBST或TBST，后者效果更好。清洗次数和时间根据具体实验来确定，清洗过少会产生过高背景；过度清洗会洗脱目的蛋白或降低信号。建议清洗3-5次，每次5min。
注意事项
Ⅰ内参选择
WB实验通常需要内参作为相对丰度的对照。内参选择需考虑目的蛋白分子量 (通常应保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5 kDa以上但勿差距太大)，表达部位和实验的具体情况，内参及选用的注意事项见上方图片
Ⅱ关于抗体回收
我们不建议抗体的回收和重复使用，因为使用过的抗体可能因浓度变化和污染问题影响预期结果。
#一抗孵育 #干货分享 #实验室日常
一抗孵育流程
根据抗体说明书稀释一抗，高倍稀释一抗可减少非特异性信号。封闭液可作为抗体稀释液，也可使用1×TBST稀释一抗；
将膜浸泡在稀释好的一抗中，需保持适当的摇动使之均匀覆盖。常见的一抗孵育条件为室温1.5-2 小时或4 °C过夜，具体取决于抗体与蛋白的亲和性和蛋白的丰度，建议使用较高的抗体稀释倍数和较长的孵育时间来保证特异性结合。另外，低温可以减少细菌生长和蛋白降解 (尤其是磷酸基团
)；一抗孵育结束后，通过洗膜去除未结合的抗体，否则会导致高背景。常用的清洗缓冲液是PBST或TBST，后者效果更好。清洗次数和时间根据具体实验来确定，清洗过少会产生过高背景；过度清洗会洗脱目的蛋白或降低信号。建议清洗3-5次，每次5min。
注意事项
Ⅰ内参选择
WB实验通常需要内参作为相对丰度的对照。内参选择需考虑目的蛋白分子量 (通常应保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5 kDa以上但勿差距太大)，表达部位和实验的具体情况，内参及选用的注意事项见上方图片
Ⅱ关于抗体回收
我们不建议抗体的回收和重复使用，因为使用过的抗体可能因浓度变化和污染问题影响预期结果。
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